蔡有龄,谭淑珍,吴燕

  摘要 目的 考察中药“疣毒清”在体外对HPV的杀灭作用,以阐明其治疗机理。方法从临床切除的CA标本中提取HPV,加入中药“疣毒清”后,在4℃下共孵,按时提取HPV-DNA,用FQ-PCR法测定其病毒含量。结果 含HPV的试管加入“疣毒清”后,经反复测试,24小时即不能测出HPV,而对照管及非相关中药管均含同等浓度的HPV-DNA拷贝。结论 “疣毒清”具有明确的杀灭HPV的作用,这一功能阐明了它在治疗CA时的机制。

  关键词    尖锐湿疣,HPV,“疣毒清”(Verrucout),FQ-PCR,F-Probe

  尖锐湿疣是发病率仅次于淋病及非淋的性传播疾病,它是由人乳头瘤病毒感染所致,病发于两性生殖器及肛周、尿道口,患者苦不堪言,目前在世界上尚无能杀灭该病毒的药物,因此它的发病率居高不下,临床上所能采用的治疗方法,无论化学的、物理的或药物的,均是以局部破坏瘤体为目的,不能杀灭病毒,除了形成局部的创面、痛苦、易感染外,且复发率极高,约为20%一40%。

  中药“疣毒清”口服治疗尖锐湿疣具有极高的疗效,且复发率极低,这种局部不作处理,单纯口服而能治愈疾病的机理,有可能是它具有杀灭病毒的功效,为了探讨这一机理,我们利用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)来研究中药“疣毒清”对病毒的杀灭作用。

  1  材料与方法

  1.1材料

  1.1.1  HPV来源:来自临床标准的尖锐湿疣标本,切取后,用生理盐水洗去血液,在无菌条件下,将标本剪碎,研磨成匀浆备用。标本来自两位病人,分别制备。

  作者单位:1首都医科大学朝阳医院(北京市100020);2中山医科大学达安基因诊断中心

  1.1.2 中药标本:采用双盲法,将药物分别标号。测试中药煎剂,与临床剂型相同。

  1.1.3 主要仪器:PE5700型荧光定量PCR仪(包括电脑及软件)。

  1.1.4 引物及荧光探针为中山医科大学达安基因诊断中心提供的HPV6,11型FQ-PCR诊断试剂盒。

  1.2试验方法

  1.2.1取尖锐湿疣组织匀浆0.6ml,分别加中药标本2.4ml,对照管加生理盐水2.4ml,置4℃冰箱内,按时提取DNA。第1次实验及第2次实验系同一病人的CA组织匀浆。第3次实验系另一病人的标本匀浆。

  1.2.2 FQ-PCR反应步骤:采用常规碱裂解法提取DNA0.2ml入薄壁反应管中,同时加入一定浓度的引物、F-PROBE、dNTP、DNA聚合酶及缓冲液等,放入PE5700荧光PCR仪,93℃2min予变性后,按93℃45s,55℃120s,反复进行40个循环,定量结果由电脑软件自动分析计算出初始拷贝数的定量结果。

  2   结果    见表1,2,3。

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  3  讨论

  3.1   FQ-PCR由于将扩增与荧光探针在试管中同时进行,不需打开反应管即可给出测定结果,大大减少了污染所致的假阳性的机会,同时扩增时即使有非特异扩增物,也因F-PROBE不能与之结合而不能被破坏,测不到荧光讯号,因而极大地提高了试验的特异性与灵敏性,保证了实验的可靠性。

  3.2   尖锐湿疣标本中病毒含量极大,在其洗涤液中即可测得为2.1x107拷贝/ml,与组织匀浆的含量(2.8xl07拷贝/ml)相同,标本中的病毒在4℃冰箱中存活至13天仍可测出为1.6x107拷贝/ml。

  3.3   尖锐湿疣的组织匀浆在加入中药“疣毒清”后,自24小时至13天,FQ-PCR恒定地不能再检出病毒,而对照管及对照中药标本管却仍继续维持原有浓度(1.6~5.3x106拷贝/ml),说明中药“疣毒清”在体外具有能快速有效地杀灭尖锐湿疣病毒的能力。

  3.4  本实验的结果,每次均有空白对照及非相关中药对照,并经过3次重复测试,其结果均相同,证明本实验的可重复性及可信性。

  3.5  本实验的结果证实,中药“疣毒清”在临床上单纯口服即能治愈尖锐湿疣,而且不再复发这一事实的机理,是由于它具有杀灭病毒的功能所致。